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npj Biofilm e microbiomi volume 9, numero articolo: 57 (2023) Citare questo articolo

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La pletora di fattori di stress che possono danneggiare le cellule microbiche ha sviluppato sofisticati meccanismi di risposta allo stress. Mentre i bioreporter esistenti possono monitorare le risposte individuali, mancano ancora sensori per rilevare le risposte allo stress multimodali nei microrganismi viventi. Le proteine ​​fluorescenti rosse, verdi e blu rilevabili ortogonalmente combinate in un singolo plasmide, denominato reporter RGB-S, consentono l'analisi simultanea, indipendente e in tempo reale della risposta trascrizionale di Escherichia coli utilizzando tre promotori che riportano lo stress fisiologico (PosmY per RpoS ), genotossicità (PsulA per SOS) e citotossicità (PgrpE per RpoH). Il bioreporter è compatibile con l'analisi standard e lo smistamento cellulare attivato mediante fluorescenza (FACS) combinato con la successiva analisi del trascrittoma. Vari fattori di stress, incluso il 2-propanolo, rilevante dal punto di vista biotecnologico, attivano una, due o tutte e tre le risposte allo stress, che possono avere un impatto significativo sulle vie metaboliche non legate allo stress. Implementato nella coltivazione microfluidica con imaging al microscopio a fluorescenza confocale, il reporter RGB-S ha consentito l'analisi spaziotemporale di biofilm vivi rivelando sottopopolazioni stratificate di batteri con risposte allo stress eterogenee.

La comprensione di come i microrganismi mediano i cambiamenti adattativi per garantire la sopravvivenza in condizioni ambientali mutevoli richiede il monitoraggio dei corrispondenti percorsi di risposta allo stress. RpoS, SOS e RpoH sono percorsi critici di risposta allo stress che modulano i percorsi trascrizionali attraverso un ampio spettro di stimoli di stress, con implicazioni per la formazione e la proliferazione di biofilm1,2, la virulenza dei patogeni3, la resistenza agli antibiotici4, l'evoluzione4 e la competizione ecologica5. RpoS è un fattore sigma alternativo che regola, direttamente e indirettamente, circa 500 geni nell'Escherichia coli (E. coli)6. Conosciuta come risposta generale allo stress, l'attivazione della RpoS è stimolata principalmente dalla fame come indicatore di stress fisiologico7. La risposta SOS comprende invece più di 50 geni che svolgono diverse funzioni in risposta al danno al DNA indotto da agenti chimici, fisici o biologici8. Pertanto, la sovraregolazione della risposta SOS è associata alla genotossicità cellulare. Il fattore sigma alternativo RpoH è il regolatore chiave della risposta allo stress da shock termico in E. coli che comprende più di 30 geni9,10. L'attivazione della risposta RpoH è stimolata dall'accumulo di proteine ​​non ripiegate nella cellula come indicazione di citotossicità.

Considerata l’elevata rilevanza di questi processi biologici per la tecnologia e la medicina, una comprensione completa dei meccanismi molecolari sottostanti è di straordinaria importanza. Ad esempio, il monitoraggio delle risposte cellulari a molteplici fattori di stress può dare un contributo importante alla comprensione della vitalità e della produttività cellulare11, come l'inibizione dei prodotti, la deprivazione di nutrienti, il pH o lo stress di taglio12, nonché per il monitoraggio di una varietà di sostanze tossiche ambientali, come erbicidi o antibiotici13. Un’analisi multimodale della risposta allo stress microbico sarebbe quindi importante non solo per la ricerca di base ma anche per i processi biotecnologici.

A questo scopo sono stati sviluppati diversi biosensori batterici geneticamente codificati12,13,14,15,16,17,18. Gli elementi reporter comunemente usati sono i reporter colorimetrici β-galattosidasi (lacZ)15 e bioluminescenza (luc, lux)16. Poiché questi sistemi di solito richiedono lisi cellulare, test multifase o reazioni catalitiche che limitano la misurazione online e la reportistica multicolore, sono stati sviluppati reporter basati sulla fluorescenza per l'analisi della risposta allo stress17,18. Tuttavia, i sistemi attualmente disponibili non hanno la capacità di riportare la risposta multimodale delle cellule viventi con elevata risoluzione spaziotemporale. Descriviamo qui un biosensore fluorescente a tre colori geneticamente codificato che mostra simultaneamente la risposta batterica allo stress fisiologico, alla genotossicità e alla citotossicità attraverso il monitoraggio dei corrispondenti percorsi di risposta allo stress (Fig. 1 e Fig. 1 supplementare).